FDA注冊號：
3010704506
低速離心機分離紅細胞的技術(shù)
發(fā)布時間：
2011-12-28
概要：
材料與試劑
1．肝素等抗凝劑 2．3％明膠液 取明膠3g，溶于0.9％滅菌鹽水100ml中，114.3℃滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存。臨用時，37℃預(yù)熱10min。 3．阿氏液
（二）操作方法
1．采血抗凝，即為紅細胞。由于紅細胞與白細胞的比例相差懸殊，一般白細胞混雜在其中，忽略不計。
2．根據(jù)紅細胞的用途，可做進一步的處理。如計算紅細胞，可直接稀釋計。如需做補體結(jié)合反應(yīng)，或其它溶紅細胞反應(yīng)，則需將紅細胞進行充分的清洗，以除去附著在紅細胞膜表面的血漿。一般用等滲的稀釋液連續(xù)清洗，2 000r/min離心10min，重復3~4次。
3．如需儲藏備用，則以阿氏液做抗凝劑采血，混勻后置4℃冰箱保存，可保存2周，其活性尚可。
淋巴細胞的分離技術(shù)
（一）材料與試劑
1．淋巴細胞分層液有兩種：
（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。應(yīng)用時，用蒸餾水配制9％溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，結(jié)構(gòu)式為3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量為60％或75％，每安瓶為20ml裝，常用于人的臟器造影。應(yīng)用時，取60％泛影葡胺原液20ml，加雙蒸餾水15.38ml，即為33.9％泛影葡胺。 1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制： 9％聚蔗糖液 24份 33.9％泛影葡胺液 10份 混合即可。必要時，可測比重。需要備用，可用G5漏斗過濾除菌或114.3℃高壓滅菌15min，4℃保存。一般可保存3月。 如要配制不同比例的分層液，可按下列公式計算： 式中dm為分層液的比重，d1和d2分別為9％聚蔗糖和33.9％泛影葡胺的比重，V1和V2分別為它們的體積。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分層液，則9％的聚蔗糖和33.9％的泛影葡胺的比例應(yīng)為100︰46.3。
（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液 34％泛影葡胺液 10份 60％右旋糖酐液 12.5份 混合，即為比重1.07～1.09的分層液。分裝于棕色瓶中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2． 3％的明膠液 稱取明膠3g，溶于0.9％的滅菌生理鹽水，終體積100ml，114.3℃高壓滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存，臨用時37℃預(yù)熱10min。 3．Hank’s液。
（二）操作方法
1．取抗凝血，自然沉降，如是馬屬動物的血液，可直接直立試管架上，讓其自然沉降1h，取上層血漿。如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3％明膠液，混勻后讓其自然沉降，1h后取上層血漿。
2．2 000r/min離心10min，棄上清。
3．沉淀用Hank’s液混懸后，再2 000r/min離心10min。
4．重復步驟3一次，再用細胞營養(yǎng)液將白細胞制成懸液。此液含有整個白細胞群，包括粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和部分紅細胞。可供白細胞計數(shù)用。
5．取2ml細胞分層液于離心管內(nèi)，同時用毛細吸管吸取約2ml的血漿（自然沉降1h的上層血漿）輕輕加入分層液上，直接加抗凝血也可。
6．以水平轉(zhuǎn)子離心機2 000r/min離心20min。離心后，可見分成多層，最下層是紅細胞，中間層是分層液，最上層是血漿。在血漿層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個核細胞層。
7．用毛細吸管插入到單個核細胞層并吸取該層，放入另一試管中。
8．以Hank’s液洗滌、離心，最后配制成適當?shù)陌准毎麧舛取１匾獣r可計數(shù)。
（三）注意事項
1．血漿或血液加入分層液中時要小心，緩慢不要打亂液層、不要搖動。也可以將分層液加入到血漿的上層。
2．保持淋巴細胞的活性是非常重要的，所以一般情況下，是現(xiàn)采血，馬上進行分離。
3．經(jīng)過分層液分離的淋巴細胞層，實際上是單個核細胞層，包括單核細胞，不包括粒細胞。欲分離出純的淋巴細胞，則按下法除去單核細胞，或收獲單核細胞。
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